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许多药物靶标被嵌入细胞膜的磷酸双分子层中，例如G蛋白偶联受体（GPCR）、离子通道、转运体和膜结合酶。越来越多的生物物理和结构研究表明，许多小分子药物通常与这些靶标嵌合在蛋白质-磷脂界面中的结合点结合。药物在与蛋白质相互作用之前，需要先在磷脂层中进行分配，这种膜进入机制必然会影响药物的药效数据、构效关系、药动学和理化性质。随着X-ray和冷冻电镜方法解析的小分子膜内结合位点的数量的增多，配体-脂质相互作用在小分子药物发挥药效时，扮演的角色比通常认为的更为重要。2021年7月13日，Nature Reviews Drug Discovery杂志发表文章¹介绍了相关概念，来帮助药物研发团队在这种靶向空间中进行合理的药物设计。

自由药物假说容易导致一个错误的观念：即所有药物必须通过水相(自由水或未结合水)途径进入其靶标。相反的，治疗靶标生物相的概念，认为作用位点处的自由药物浓度是发挥药理活性的要素，揭示这一概念需要利用新的结构信息进行更深入的研究。对于膜蛋白靶标，应当将膜视为药物进入对应结合位点的生物相。很多与蛋白质-脂质界面的膜内位点结合的配体，只有部分结构参与了靶蛋白相互作用，其余大部分结构则完全暴露在脂膜中。新的具有典型的药效研究支撑的结构数据表明：配体-膜相互作用在药物发挥药效过程中可能被低估了。

膜蛋白上的小分子结合位点可以根据它们从脂质双分子层进入和暴露的情况进行分类。在细胞内和细胞外均显示的具有大结构域的完整膜蛋白，可能具有类似于传统描述的可溶性蛋白的小分子结合位点（见图1a）。另外，在蛋白质跨膜区发现的结合位点可按配体通过水相或膜相的途径，以及它们与跨膜α螺旋(螺旋表面结合和螺旋内结合)的关系进行分类。螺旋内结合位点位于α-螺旋之间形成的口袋内，包括经典的GPCR正构体和离子通道孔位点，这些位点通常暴露在细胞外环境中，药物分子可通过水相进入（见图1b）。

然而，正如上文所述脂质双分子层也可能作为小分子通路的相关生物相。事实上，正如许多实验结构所揭示的那样，GPCR和离子通道可能具有膜暴露的开窗，使小分子通过膜和水相进入结合位点（图1c）。在GPCR、离子通道和转运体中发现了越来越多的非经典和变构调节位点，这些位点大到足以完全包裹一个小分子配体（图1d）。而其他位点则可能相对较浅，大部分配体暴露在脂质相中（图1e）。这些亚类之间有实质的区别，因为膜暴露对药物的物理化学性质有很大的影响。另外，外螺旋结合位点主要位于由跨膜α-螺旋形成的膜暴露的蛋白质表面（图1f），这种结合位点极具代表性，药物分子暴露在脂膜层，只有一小部分与蛋白表面有相互作用。

在考虑药物进入时，还必须考虑膜蛋白靶点的功能和动力学。特定小分子结合位点的存在，或者说进入它的途径，可能与蛋白质的构象或‘状态’至关重要。随着GPCRs通过其激活周期或者离子通道门的打开和关闭，以及转运体经历大量的构象重排，这些结构变化频繁地影响小分子结合位点及相关的药理和效价。此外，小分子可能与周围的大块膜脂竞争结合目标蛋白，特别是在螺旋内和螺旋外位点。事实上，药物结合已经被证明会在一些结构上分解良好的配体结合位点上取代脂质。

图1 受体结合模式¹

通过膜相进入膜结合目标的结合部位，必然要求配体在与靶标结合之前首先进入脂质双分子层。小分子在脂质双分子层内积累和排布的相对能力影响药物的各个基本方面，包括可观测的亲和力、药代动力学(如暴露量和半衰期)和作用持续时间。沿着这些路线，有几种小分子设计策略可用来促进膜分布和随后与膜内位点的结合(图2)。在发现计划的早期识别膜内结合位点可以极大地帮助合理的药物设计，并可能最终加速候选药物的成功发展。

图2 在蛋白质-磷脂界面上的药物设计。策略亲脂性分子(图2a)或亲脂尾巴(图2b)可以增加脂质双层内的药物浓度。碱性胺(图2c)可能与膜脂的阴离子磷酸盐结合，而更多的亲脂功能可能与膜核内的疏水酰基相互作用。由于小分子构象或分子内氢键网络，膜靶向药物的极性功能常常被屏蔽在疏水的膜环境(图2d)之外。当结合到膜内结合位点(图2e)时，极性基团如氢键供体或带电基团被埋藏在蛋白质位点内，而疏水基团暴露在膜环境中¹。

表1收集了膜内结合位点的代表性例子，按蛋白质类别(如GPCRs、离子通道、转运体等)组织，特别注意具有脂质暴露或膜可及结合位点的结构。从旨在优化配体-蛋白相互作用的传统SBDD策略的角度来看，表1中的许多膜蛋白结构都是一个独特的挑战。

由于许多配体直接暴露于脂质双分子层相，似乎只存在有限的结构信息可以指导SBDD。但是本文仍然可以通过讨论药物与膜相互作用的经典例子，将以前的药理观察和膜通道假说与最近的结构数据联系起来。以及从现代例子中考虑了新的可利用的配体结合蛋白结构以及已发表的构效关系(SARs)。尽管静态地看待结合配体可能会掩盖更复杂的靶动力学或可能有助于药物活性的三元相互作用，但新获得的结构信息为探索膜上药物作用的新假说提供了契机。

表1 选择的配体结合蛋白结构具有膜进入途径¹

Meyer和Overton的麻醉脂质理论实质上已经从一个注重膜双分子层性质变化的机制演变为现在主流的蛋白质理论。全身麻醉剂脱氧烷和异丙酚与细菌五聚体配体门控离子通道结合的X-ray结构的发布，有助于在结构水平上巩固蛋白质理论(图3a)。两种麻醉剂均可通过脂质双层结合在的同一螺旋内跨膜腔。脱氧烷以其高度氟化的结构为特点，它可以增加亲脂性和膜分配，用于多种全身麻醉剂，同时减少可燃性和代谢不稳定性。

图3 结构数据阐明了经典的膜内结合位点。与配体(由球体表示)形成的复合物中膜蛋白结构的透明表面呈现揭示了膜内位点的结合。化学结构根据蛋白质或脂质暴露而着色，部分暴露在脂质环境中的配体呈红色¹。

在其结构阐明的几十年之前，详细的电生理学实验揭示了电压门控钠(Nav)通道中枢腔孔阻滞剂的状态依赖配体结合途径。在所提出的结合模型中，静息态的孔道通过膜进行封锁；而开放状态下，通往胞液的溶剂可及通道。最近一个与抗心律失常药物氟卡尼(图3b)形成复合物的Nav1.5心脏通道结构(图3b)支持疏水或中性药物可能通过脂质相到达孔道部位的经典理念，该复合物在孔道内存在横向开窗，可提供配体直接从脂质双分子层进入。与此假设一致，对细菌通道开窗大小的进行突变，会调节氟卡尼的亲和力。氟卡尼是一种高度氟化的结构类似物，它的发现和发展利用了氟的高脂溶性和相对较小的范德华半径来靶向这一独特的膜内结合位点。

L型钙通道阻滞剂的膜分离能力有助于解释在二氢吡啶类抗高血压药物中观察到的亲和力、PK和作用时间。例如，尼莫地平（Nimodipine）是一种快速和短效的阻断剂，它的平衡膜分配系数比长效阻断剂氨氯地平（amlodipine）和拉西地平（lacidipine）低得多。这很大可能是因为氨氯地平主要通过延长血浆半衰期和添加与膜相关的碱性伯胺来获得其长效特性。对钙离子通道与包括氨氯地平(图3c)在内的多种二氢吡啶调节剂复合物的研究发现，在脂质双分子层的深处有一个螺旋内的结合位点。这些结构与二氢吡啶类药物的局部膜浓度对解释其观察到的活性至关重要的假设一致。

吸入β2肾上腺素受体(β2AR)激动剂提供了药物作用中配体-膜相互作用的另一个经典例子。长期以来，人们认识到长效β2AR激动剂沙美特罗（salmeterol）的苯烷氧烷基尾有助于延长作用时间，最近的X-ray共晶体结构显示沙美特罗位于β2AR上的一个溶剂可及的正构体位置，苯烷氧基烷基尾与受体之间有广泛的接触(图3d)，这一模型应征了早期的“外显位(区)”模型，该模型提出配体-蛋白质相互作用将药物困在受体附近。现有的药理证据也表明，苯烷氧基烷基尾与脂膜之间的物理化学作用，观察到增加了局部药物浓度和作用时间。缺乏沙美特罗拉长尾巴的短效β2AR激动剂沙丁胺醇的亲和力、膜分配和作用时间的减少证明了这一假说。相反，内在受体亲和力和膜分配能力的结合最好地描述了β2AR部分激动剂的活性，突出了药物-脂质相互作用的相关性，即使配体结合位点不直接暴露于脂质双层。

图4 新兴膜内结合位点的结构数据。膜蛋白结构与配体(以球体为代表)的复合物的表面呈现显示膜内结合位点。透明的表面绘制用于说明螺旋内结合位点。化学结构根据蛋白质或脂质的暴露而着色，部分配体暴露在脂质膜上呈红色¹。

P2Y1受体拮抗剂的发现，为药物在膜蛋白界面的设计提供了一个有价值的案例研究。最近的结构工作进展极大地阐明了现有的已发表数据，包括广泛的SAR和无关基于结构的药物设计的理化数据。非核苷酸拮抗剂BPTU对P2Y1受体的结晶，显示了一个高度膜暴露的螺旋外调节位点(图4a)。值得注意的是，这种很大程度上疏水性且结合位置较浅的口袋，具有BPTU的尿素基团与蛋白质上氢键受体之间的双齿氢键作用。BPTU母核上的亲脂取代对提高亲和力至关重要，叔丁基和三氟甲氧基取代提供了亲和力和代谢稳定性的最佳平衡。BPTU的高亲脂性和低溶解性是典型的针对高度膜暴露结合位点的中性配体，克服典型的螺旋外位点是P2Y1拮抗剂研发的关键挑战。与这些观测结果一致，一个特别丰富的计算模拟描述了BPTU从水相到膜嵌入结合位点的路径。这项工作表明，配体在受体结合前聚集在脂质双分子层的特定区域，是由BPTU的尿素基团与磷脂的二酰甘油骨架之间的极性相互作用介导的。

最近与FDA批准的增效剂依伐卡托（ivacaftor）结合的囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)的冷冻的电Cryo-EM结构也揭示了脂质双分子层内的一个外螺旋结合位点（图4b）。令人惊讶的是，大约60%的依伐卡托的分子表面暴露在膜上，这表明只有有限的配体-蛋白质相互作用对亲和力有帮助。对配体结合模式的分析也表明，依伐卡托的极性部分被屏蔽在膜环境之外，而更多的亲脂性部分则指向脂质膜。依伐卡托具有与BPTU惊人的相似性质，具有高亲脂性，低溶解性和延长的体内半衰期。尽管依伐卡托这种非传统的作用特征，然而它已经改变了囊性纤维化的治疗，突出了外螺旋结合位点作为药物研发焦点的重要意义。

用于治疗哮喘的TRPA1拮抗剂GDC-0334的发现，提供了一个针对离子通道上膜暴露的螺旋内结合位点的药物研发的案例（图4c）。Cryo-EM结构显示GDC-0334的脯氨酸磺酰胺部分结合在较浅的疏水的螺旋内口袋中，而双三氟甲基-二芳基基团则充分暴露在膜上。GDC-0334与其他具有膜暴露结合位点的药物具有许多相同的一般性质，包括水溶性差和高被动通透性。在这类TRPA1抑制剂中，降低亲脂性同时提高亲和力的努力最终都失败了，因为亲脂性对于体外和体内亲和力都是必要的，这可能与膜暴露结合位点有关。值得注意的是，GDC-0334中的8个氟原子通过增加脂溶性提供了增强的亲和力，同时也阻断了代谢，增加了体内半衰期。Cryo-EM结构最终表明，双芳基类似物之间观察到的亲和力差异并不是通过配体-蛋白质相互作用的改善来解释的。相反，双芳基基团可能是亲脂尾巴，有助于增强脂质相互作用和膜分裂。

在用于2型糖尿病潜在治疗的GPR40(又称FFAR1)激动剂fasiglifam(TAK-875)中也观察到了有利于小分子-膜相互作用的亲脂尾，该激动剂同时还具有另一个膜暴露的螺旋内结合位点(图4d)。fasiglifam-GPR40共晶体结构显示：二氢苯并呋喃部分与螺旋内结合，而末端二甲苯基和甲基丙氧基则向膜相方向移动，与其他官能团相比，甲酰丙氧基尾具有较高的活性，表明两亲性磺酰基虽然降低了亲脂性，但与周围的脂质环境有良好的相互作用。

在了解如何设计分子之前，小O先把细胞膜成分与大家复习一下。在脂质双分子层中，最丰富的甘油磷脂具有一个典型的结构，包括一个极性头基团，一个阴离子磷酸盐和一个二酰基甘油主链，通过酯键连接两个可变的疏水脂肪酸(见图5a部分)。这些脂质主要区别于极性头基团的身份，其中可能包括胆碱、乙醇胺、丝氨酸和肌醇。具有代表性的甘油磷脂由棕榈酸和油酸衍生的脂肪酸链描述(见图5a部分：POPC、POPE、POPS和POPI)。鞘磷脂(见图5b部分)代表另一种主要脂质，其通常特征是与神经酰胺连接的磷酰胺，其中包括酰胺连接脂肪酸和次级烯丙醇。脂质的两亲性促进了它们自发组装成膜双分子层，在生理组成和温度下，可以被描述为流体二维相。极性头基团暴露在细胞内和细胞外的水环境中。

 
图5细胞膜组成细胞膜由一系列磷脂、甾醇和跨膜蛋白组成¹。

为了优化配体-膜相互作用和亲和力，以下概述了在蛋白质-磷脂界面上进行药物设计的几种一般策略(图2)。靶向膜蛋白的小分子不需要包含下面描述的所有策略元素就可以获得成功。相反，拟议的策略代表了具有膜内结合位点的药物的共同特征，旨在激发创造力，而不是规定特定的方法或方法。从最简单的意义上讲，蛋白质-磷脂界面的理性设计可以在表征屏蔽膜疏水环境极性的同时合理利用亲脂性。加强或尽量减少配体-膜相互作用应当在仔细调查对药理学、PK、疗效和特定靶标的安全性的影响后进行评估。这与一般的药物设计策略是一样的，并无特别之处。用最简单的术语来说，在蛋白质-磷脂界面的合理设计可以是明智地利用亲脂性，同时屏蔽极性免受膜的疏水环境的影响，增强或最小化配体-膜相互作用的价值。

图6 药物设计策略梳理

目前，在基于结构的药物设计(SBDD)中，对膜通路机制和药物-脂质相互作用的讨论仍然存在争议。随着基于特性的药物设计的出现和对高度亲脂性药物的不良毒理学结果认识的提高，大多数现代药物发现方案倾向于降低亲脂性，以减少临床失败率。然而，事实真的如此吗？本文对于一些药物-脂质相互作用的实例似乎揭示了这并非是一个完全正确的经验。无论真相如何，对膜通路机制和药物-脂质相互作用越了解，就越能合理利用亲脂性的同时屏蔽极性免受膜的疏水环境的影响，对药物设计的帮助就越大！

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深圳晶蛋生物医药科技有限公司成立于2019年8月，致力于慢性肾病、抑郁症和恶性肿瘤等重大疾病的膜蛋白创新药物研发，立志成为全球极具创新力和影响力的企业，近日已完成近亿元Pre-A轮融资。

核心团队由哈佛大学、中科院上海药物所等多所顶尖科研院所和制药公司的博士组成，在膜蛋白抗原抗体、药物靶点结构解析、基于结构和人工智能的药物研发和药理学等领域的研发能力处于国际一流水平。

公司于2020年获得中国深圳创新创业大赛生物医药行业一等奖、2020年“科创中国”先导技术奖、第九届中国创新创业大赛全国优秀奖、科创中国科技创新创业大赛TOP10和粤港澳大湾区生物科技创新企业50强等奖项。

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