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导读

       近年来，大分子生物药（单抗，双抗，ADC以及干扰素）研发热潮一浪高过一浪，这并不代表小分子药物市场的衰退，恰恰相反，小分子药物因其独特的优势（可以靶向胞内胞外，研发成本相对较低，工艺相对熟练），依然是新药研发的主战场。从2020年FDA批准了53个新药，而小分子新药占了38个这个数据就可证实。此外，小分子药在生物药冲击的浪潮之下，并没有固步自封，闭门造车，而是不断更新技术。如图1，各种蛋白降解技术（PPOTACs、LYTACs、Molecular Glue、AUTAC等）作为新兴小分子药物研发的一个利器，引领创新药风向从传统药物靶标（占人体靶点约20%）转向更具挑战性的“不可成药”靶标（占人体靶点约80%）。

图1 蛋白降解技术简图⁵

       细胞在维持体内环境稳态的过程中，需要将细胞代谢、营养感知、质膜修复、分泌过程以及应激等病理过程产生的“废料”清除，而清除的过程中需要用到的两大蛋白质和细胞器降解系统分别是：泛素-蛋白酶体系统，溶酶体系统。大部分蛋白降解技术都是围绕着这两个体系发展延伸的，让小0带领大家一起学习各种蛋白降解技术吧。

泛素-蛋白酶体系统

         基于泛素-蛋白酶体系统的PROTAC技术和分子胶技术是蛋白降解技术发展的“双子星”。相比其他还处于发展中的技术，这两项技术的发展以及遥遥领先。

1PROTAC技术

       蛋白降解靶向嵌合体PROTAC是一种杂合双功能多肽或小分子化合物，PROTACs分子量一般在700~1200之间。其结构类似于哑铃，一端是泛素连接酶E3配体，另一端是与细胞中目标靶蛋白结合的配体（POI），两端之间通过Linker相连，从而形成“三体”聚合物—靶蛋白配体-Linker-E3配体。如图2，E3泛素连接酶可通过将一种叫做泛素的小蛋白“粘贴”在靶蛋白上，将靶蛋白标记为缺陷或受损蛋白，然后，利用细胞内在的蛋白“粉碎机”（即26S蛋白酶体）可以识别和降解被标记的靶蛋白。简而言之，就是标靶蛋白被打上泛素化标签-被识别-被降解。

图2 PROTAC作用机制（网图）

PROTAC新兴技术很多，以下简单介绍几种有代表性的PROTACs:

       光控PROTAC：Trauner课题组开发一种光控的蛋白质降解技术（PHOTAC），通过将偶氮苯结构作为光开关，引入到PROTAC分子结构中，从而实现光诱导的靶蛋白降解。
       抗体-PROTAC偶联物：Tate课题组将PROTAC概念应用到抗体偶联药物的设计中，通过将曲妥珠单抗与PROTAC进行偶联，选择性降解HER2阳性细胞的溴结构域蛋白4（BRD4），从而实现PROTAC技术的细胞特异性。

       抗体类AbTAC：如图1，AbTAC也通过内吞-溶酶体途径诱导胞外蛋白和膜蛋白的降解，因此AbTAC虽然冠PROTAC之名，但与LYTAC的关系更为密切。AbTAC本质上是一个重组的双特异性抗体，一个臂靶向细胞表面的目标蛋白，一个臂靶向跨膜的E3连接酶，例如RNF43(RNF43是一个单次跨膜的E3连接酶，包含膜外结构域，跨膜结构域和RING细胞内结构域)，从而引起三元复合物的内吞和溶酶体降解。第一个AbTAC由加州大学旧金山分校的Wells课题组开发，通过重组双特异性抗体成功将肿瘤细胞表面的PD-L1分子成功引导到溶酶体降解。相对LYTAC，AbTAC能降低嵌合体分子的免疫原性，但其是否可以回收再利用等具体机制还有待研究。

       纳米抗体GlueTAC:北京大学的陈鹏课题组首次报道了基于纳米抗体构建的GlueTAC技术。如图3，研究人员对天然的纳米抗体进行了改造，在纳米抗体CDR3的结合区域引入了一个非天然氨基酸（红色火柴头），这使得改造后的纳米抗体和靶蛋白形成共价键的牢固结合，一旦和靶蛋白形成特异性结合后，很难再解离。改造后的纳米抗体被命名为Glueody（浅蓝色）。为了提高内吞效率的稳定性研究人员在Gluebody上耦连（Sortase A介导的蛋白耦连）了CPP-LSS多肽（CPP浅灰色、LSS深蓝色）。

 

图3 GlueTAC作用机制¹

分子胶Molecular Glue技术

       分子胶通过修饰泛素化连接酶表面进行改性，从而识别并降解目标蛋白。与PROTAC类似，分子胶技术也可以引起靶蛋白的泛素化和降解。与PROTAC不同的是分子胶是小分子量化合物，并且能够作用于没有小分子结合口袋的不可成药靶点（注：人体细胞中~80%蛋白没有小分子结合口袋）。

双机制降解剂技术

       双机制降解剂(Double-mechanism degrader)则是单一分子可分别扮演PROTAC和分子胶的角色，诱导两种目标蛋白的降解，有提升治疗效果的潜力。清华大学药学院的饶燏教授团队开发了一种代号GBD-9的小分子，其可以作为PROTAC促进BTK降解，也可以作为分子胶促进翻译终止因子GSPT1的降解。在多种癌细胞系中显示出比小分子BTK抑制剂依鲁替尼更强的抗肿瘤作用，有可能克服BTK抑制剂无法治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤以及急性髓细胞白血病。

溶酶体系统

       溶酶体是一种酸性细胞器，通过内吞和自噬作用从质膜或细胞质中接收物质，并将其降解和循环利用。内吞的物质被结合，并通过早期的内体、内体载体小泡、晚期的内体和溶酶体进行随后的水解。自噬途径始于一种被称为吞噬载体的孤立的膜结构，该结构来源于脂质双层和脂化的LC3蛋白。这种吞噬体会膨胀，吞噬细胞内的货物(自噬底物)，包括蛋白质和其他生物分子，甚至细胞器，从而将它们隔离在一个叫做自噬小体的双层小泡中。装载的自噬体会随着蛋白的降解而成熟。因此，内体/溶酶体途径和自噬途径都能够降解靶物质。如图4，LYTAC、ATTEC和AUTAC技术是目前进展较快的溶酶体体系蛋白降解剂。

 

图4 溶酶体系统的蛋白降解技术²

内吞-溶酶体途径

       内吞-溶酶体途径主要负责胞外蛋白与跨膜蛋白的降解，在细胞的营养摄取、信号传递、抗原呈递和储存等过程中发挥着重要作用。溶酶体靶向嵌合体LYTAC技术利用内吞-溶酶体途径，有效地实现胞外蛋白和膜蛋白的降解。

       如图4A，LYTAC主要由两个结合域组成，其中一个是靶向细胞表面的溶酶体靶向受体LTR（lysosome-targeting receptor）的寡聚糖结构，另一个是靶向靶蛋白的抗体、多肽或小分子，两者通过一个Linker连接在一起。目前已报道的溶酶体靶向受体主要有两种，分别是非阳离子依赖型20-或90-聚体的甘露糖-6-磷酸受体（cation-independent mannose-6-phosphate receptor，CI-M6PR）和去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）（图5）。LYTAC与PROTAC不同，PROTAC通过蛋白酶体降解靶蛋白，通常适用于细胞内蛋白。而LYTAC可以通过细胞膜表面的溶酶体靶向受体诱导蛋白质向溶酶体迁移，因而也可以靶向细胞外蛋白和跨膜蛋白，且不依赖于泛素化和蛋白酶体。

 

图5 LYTAC的两种受体形式³

       双特异性核酸适体嵌合体(Bispecific aptamer chimera)和LYTAC类似，也通过内吞-溶酶体途径介导目标蛋白降解。但其化学本质与LYTAC不同，其由两个分别靶向目标蛋白和LTR的核酸适体偶联得到，也是通过与LTR及目标蛋白形成三元复合物内吞来降解目标蛋白。上海交通大学的韩达报道了第一个双特异性核酸适体嵌合体，实现了对间质表皮转化因子c-Met和酪氨酸蛋白激酶7的快速降解，在抗肿瘤方面有较好的开发潜力。相较于LYTAC，双特异性核酸适体嵌合体有制备更为简单、连接方式确定、稳定性更好的优点。

自噬-溶酶体途径

       自噬是细胞清除自身受损或无用蛋白质或细胞器，维持细胞的稳态和正常生命活动的重要过程。利用自噬途径开发的蛋白质降解技术主要有AUTEC、ATTEC及基于CMA的嵌合体技术。

       如图4B，自噬体束缚化合物AUTAC主要由3部分组成，分别是靶蛋白的靶向配体、Linker和降解标签鸟嘌呤衍生物（GD）。AUTAC的作用原理是通过降解标签模拟S-鸟苷酸化修饰，诱导靶蛋白的多聚泛素化，进而招募自噬体实现溶酶体途径降解。AUTAC与PROTAC相似，也是通过诱导靶蛋白的多聚泛素化实现蛋白质降解，但是AUTAC分子不是将POI拴在E3连接酶亚单位上并触发K48多泛素化，而是触发K63多泛素化，K63多泛素化被选择性的自噬途径识别，导致靶POI的降解，因此具有更加广泛的降解范围，不仅可以降解细胞质蛋白，还可以实现降解个头较大的细胞器，包括内质网、线粒体和过氧化物酶体等。

       如图4C，ATTEC即自噬小体绑定化合物，该化合物可同时作用于靶蛋白和自噬小体蛋白LC3，从而拉近靶蛋白与LC3之间距离，实现两者的捆绑。LC3可进一步诱导自噬泡包裹靶蛋白，形成自噬小体，随后将自噬小体运输到溶酶体，从而实现靶蛋白的降解。ATTEC可以与关键的自噬蛋白LC3和致病蛋白（如图突变mHTT蛋白）特异性结合，而不与正常蛋白结合，并且可以将病原性材料包装到自噬体中进行降解。ATTEC分子通过直接与自噬蛋白LC3相互作用，绕过泛素化过程，具有很大的潜力降解不同类型的靶标，包括自噬识别的非蛋白质货物，如DNA/RNA分子，受损的细胞器等。一些ATTEC分子能够通过血脑屏障，并在约100 nm的浓度下发挥作用，这为药物发现提供了别致的切入点。

       同样通过绕过泛素化过程与自噬蛋白结合的还有自噬靶向嵌合体AUTOTAC分子（图1），该分子由三部分组成：目标蛋白的配体、linker、可启动自噬的p62蛋白的配体。AUTOTAC同时结合目标蛋白和p62的ZZ结构域，并促进p62的寡聚化和活化，使目标蛋白降解。AUTOTAC不仅可以介导雄激素受体等单体蛋白的靶向降解，还能介导与阿尔兹海默相关的聚集性Tau蛋白的降解，这一点便是AUTOTAC相比PROTAC的优势所在，为蛋白降解领域提供了一个针对聚集性蛋白的新策略。

 

图6 AUTOTAC工作机制⁶

       如图7，CMA嵌合体是利用CMA机制设计的一类双功能分子，主要是嵌合多肽。首先，蛋白HSP70的复合物识别靶蛋白的KFERQ基序，与靶蛋白形成大复合物；随后，该大复合物与溶酶体相关膜蛋白2A（LAMP2A）相互作用，LAMP-2A经过多聚合、底物异位最终实现溶酶体自噬降解。

 

图7 CMA作用机制⁴

表1^2,5各种蛋白降解剂对比

总结

       目前，蛋白降解疗法已成为备受医药企业青睐的研发方向之一。其中发展最快的是分子胶和PROTAC技术，BMS的分子胶来那度胺年销售额已达128.91亿美元，Arvinas的PROTAC分子ARV-471今年将启动III期临床，基于溶酶体的靶向降解发展时间较短，目前仍处于临床前阶段。随着科学的进步和技术的发展，蛋白降解疗法可以取得更多突破性的进展，研发出更多First-in-class药物，早日造福广大患者。

       蛋白降解技术虽然热门，但是仍然存在很多疑问，小O浅谈几点：

       1. LYTAC目前主要是大分子，如何变成小分子，怎么解决高聚合度大分子量导致的体内代谢困难问题？

       2. AUTAC导致靶蛋白K63泛素化的机制是什么？

       3. ATTEC与LC3结合的结构生物学基础是什么？

       4. PROTAC依赖特定几个E3泛素化连接酶的表达以及蛋白酶体介导的降解，如何走出局限发展新技术？