时间:2022-06-23作者:小O
GPCR(G蛋白偶联受体)作为重要的药物靶点近年来受到了大家的高度重视,尽管现在市面上有很多针对GPCR的药物研发,但是由于GPCR抗原的低表达性和复杂结构,使得制备具有活性的GPCR抗原方面存在极大困难,因此治疗性GPCR抗体药物的研发也一直被推迟,并且存在一定挑战性。今天小O就带大家来了解下各种GPCR抗原制备方法的优势与不足之处~
目前比较常见制备GPCR抗原的技术主要有:
重组GPCR细胞外区多肽
由于膜蛋白在外源细胞中表达较差,并且多通道膜蛋白(如G蛋白偶联受体)的构象更为复杂、稳定性更低,所以绕过这一瓶颈的方法是表达他们的细胞外结构域(N端或Loop区),为了分离识别GPCR细胞外区域的抗体,一般是通过化学结合或基因融合设计的肽段,该肽段包含GPCR细胞外区域的一部分与载体蛋白(图1)[1]。
图1 重组GPCR细胞外区多肽
带有GPCR的洗涤剂胶束
由于跨膜区域的疏水性,膜蛋白在不含磷脂的水溶液中经常发生错误折叠、变性或聚集[2]。因此,为了创造膜样环境以保持膜蛋白的稳定性和完整性,需要在洗涤剂存在的情况下纯化膜蛋白(图2),然后将多余的洗涤剂透析出去。
图2 带有GPCR的洗涤剂胶束
带有GPCR的脂质体
脂质体是一种更接近于膜蛋白天然环境的双层结构(图3)并且可以携带膜相关分子,当膜蛋白和脂质体重组结合时形成蛋白脂质体。蛋白脂质体可以很好的保持膜蛋白与其天然结构、活性和正确折叠。
图3 带有GPCR的脂质体
带有GPCR的纳米圆盘
纳米圆盘是一种大分子结构(图4)。纳米圆盘由自组装的磷脂和衍生自人血清载脂蛋白 A1 的膜支架蛋白形成。通常,磷脂可以溶解在洗涤剂胆酸盐中。在将膜支架蛋白添加到胶束混合物中并去除额外的洗涤剂后,纳米圆盘会自组装。
或者,大约每1000个磷脂分子可以结合成一个磷脂双分子层,两个载脂蛋白包裹在双分子层上,从而保护磷脂分子的疏水键,通过体外转录-翻译偶联,膜蛋白便可从头插入到纳米圆盘中。
图4 带有GPCR的纳米圆盘
带有GPCR的病毒样颗粒(VLP)
VLP的制备是通过膜蛋白表达载体瞬时转染表达逆转录病毒衣壳的哺乳动物细胞,然后逆转录病毒衣壳从膜蛋白上引导出芽,从而携带膜蛋白(图5),在其表面显示高水平的目标蛋白,以其天然构象呈现浓缩的膜蛋白。
图5 VLP的制备
纯化的GPCR全长蛋白
由于天然的蛋白存在翻译后修饰,而且结构比较复杂(除了线性表位还有结构表位),因此天然纯化的蛋白质是很好的抗原。
图6 纯化的GPCR全长蛋白
过表达的GPCR细胞系
为了使膜蛋白的所需构象更自然地稳定,可以使细胞过表达目标膜蛋白(图7)。细胞表达膜肽或膜蛋白的免疫策略也被有效地用于产生调节离子通道功能的抗体。
图 7 过表达的GPCR细胞系
DNA免疫
受体的DNA编码可以传递到宿主体内(图8),宿主既能表达膜蛋白,又能产生针对该蛋白的抗体。使用基因枪可以引入包被的DNA颗粒,使它们由呈递抗原的细胞表达出来[3]。
图8 DNA免疫小鼠
这些抗原各自的优缺点如表1 所示
表1 各种抗原优缺点
总而言之,一份好的抗原,无论是哪一种方式制备的抗原,都应该遵守以下原则:
分子量大
大分子物质相比于小分子能在体内停留更长时间,拥有更多的机会和免疫细胞接触产生抗体。
外源性强
由于机体的自身免疫耐受,与机体自身物质相似度高的物质一般不会引起机体的免疫反应,只有外源性强的物质机体才能迅速作出免疫反应。
结构性强
从微观层面来说,结构越简单的序列一般抗原性会越弱,如淀粉、多聚氨基酸等。
降解性好
作为抗原必须是可降解的,不能降解的物质一般免疫原性会很弱。
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核心团队由哈佛大学、中科院上海药物所等多所顶尖科研院所和制药公司的博士组成,在膜蛋白抗原抗体、药物靶点结构解析、基于结构和人工智能的药物研发和药理学等领域的研发能力处于国际一流水平。
公司于2020年获得中国深圳创新创业大赛生物医药行业一等奖、2020年“科创中国”先导技术奖、第九届中国创新创业大赛全国优秀奖、科创中国科技创新创业大赛TOP10和粤港澳大湾区生物科技创新企业50强等奖项。
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参考文献
1. Antigen Design for Successful Isolation of Highly Challenging Therapeutic Anti-GPCR Antibodies.Int J Mol Sci.Man-Seok Ju, Sang Taek Jung 2020 Nov 3;21(21).
2. Generating Recombinant Antibodies to Membrane Proteins through Phage Display.Antibodies (Basel).Huang, Renhua.Kiss, Margaret M.Batonick, Melissa.Weiner, Michael P.Kay, Brian K. 2016 May 2;5(2)
3. Opportunities for therapeutic antibodies directed at G-protein coupled receptors.Catherine J. Hutchings,Markus Koglin,William C. Olson,Fiona H. Marshall. Expert Opin Drug Discov. 2020 Nov;15(11).
4. Antibody Therapies Targeting Complex Membrane Proteins.Engineering.To'a Salazar, Georgina.Huang, Ziyi.Zhang, Ningyan.Zhang, Xue-Guang.An, Zhiqiang.2021
5. Engineering therapeutic antibodies targeting G-protein-coupled receptors.Exp Mol Med.Jo, Migyeong.Jung, Sang Taek. 2016 Feb 5;48:e207.