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GPCR(G Protein-Coupled Receptor)，即G蛋白偶联受体，是哺乳动物基因组中最大的膜蛋白家族，广泛分布于中枢神经系统、免疫系统、心血管、视网膜等器官和组织，参与机体的发育和正常的功能行使。而如果与其相关的细胞内通路调节发生异常，或者外源病原物以之为受体攻击机体细胞，则会导致一系列疾病的发生。因此，GPCR被视为重要的药物开发靶点。GPCR蛋白的提取表达上存在一定的技术壁垒，运用纳米抗体技术则可以打破壁垒。

G-蛋白偶联受体(GPCRs)，也被称为7个跨膜受体，G蛋白连接接受器，是一个跨膜受体的蛋白质家族，它将细胞外信号(配体结合)转化为细胞内信号(g蛋白激活)。GPCRs是已知的最大的蛋白质家族，其成员参与所有类型的刺激反应途径，从细胞间通讯到生理感觉。功能的多样性由家族成员所能识别的多种配体匹配，配体类别可从光子(视紫红质，原型 GPCR)到小分子到蛋白质(例如趋化因子受体)。这种普遍参与正常生物过程的结果涉及GPCRs会在许多病理条件下完成，这导致GPCRs成为现代药物的热门靶点。

GPCR按氨基酸序列相似性可以分为7个家族，人GPCR蛋白目前按系统发生分析方法（phylogenetic analyses）可以分为5类（GRAFS)。

 
图1：GPCR家族分类^[1]

在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区。纳米抗体（Nanobody,Nb） 即重链单域抗体VHH (variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody)，其单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位。

图2：从左到右的经典抗体(左)、重链抗体(中)和来源于重链抗体vhh或纳米体(右)的单结构域抗原结合实体的组成^[2]

一般来说，抗体 (Abs) 由 2 条相同的重链和 2 条相同的轻链组成，它们被组织为一个片段可结晶 (Fc) 区（由 CH2 和 CH3 结构域组成）和两个可变的 Ag 结合片段（Fabs，由 CH1 组成-VH 和 CL1-VL κ 或 λ 结构域）（图 2）。由于基因重组、突变和体内选择的高度复杂系统，人类免疫系统会产生对其靶标具有特别高亲和力的常规抗体。这主要是位于 Fab 片段可变结构域 (VH, VL) 内的互补决定区 (CDR) 的结果，它们负责与表位的相互作用 。构成抗体尾部区域的 Fc 区可以与 Fc 受体或 C1q 分子相互作用，从而通过不同途径激活免疫系统，例如抗体依赖性细胞毒性 (ADCC) 和补体依赖性细胞毒性(CDC)。尽管人体中存在不同的抗体形式，但大多数治疗形式都涉及来自 IgG 同种型的抗体。

与小分子相比，纳米抗体除了具有高亲和力和特异性外，还可以减少给药频率，并且在患者之间的药代动力学变异性更小。

与传统抗体相比较，纳米抗体体积小，分子量（约15 kDa）只有传统抗体的十分之一，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。纳米抗体具有更优势的互补位，可以结合隐蔽的表位点，可穿透血脑屏障。更重要的是纳米抗体保持了与原重链抗体相当的高结构稳定性、溶解性以及与抗原的结合活性，同时可以在细菌和酵母中高产量生产表达。

GPCR在细胞膜上始终处于一个动态过程，存在多种构象变化。GPCR反向激动剂（inverse agonist），拮抗剂（antagonist）或激动剂（agonist）与GPCR结合诱导不同的构象变化。获得并分析GPCR的晶体结构对于研究GPCR与配体结合时的结合位点和构象、功能和调节及药物设计非常重要。

目前，多数GPCR晶体结构是在小分子拮抗剂结合状态下获得的非激活构象。对于小分子激动剂结合状态下的GPCR激活构象，因其呈现为非均质相，则难以获得具高分辨率的晶体结构。利用纳米抗体的体积微小、具高特异性、高亲和力的特点,且通过稳定GPCR柔性受体结构，纳米抗体已充当结晶伴侣、构象生物传感器和药物发现工具。

构象变化也在与病理相关的靶点诱导信号通路中发挥作用，通过解剖连接疾病构象和目标相关病理的信号通路，有助于我们进一步理解GPCR生物学，扩大药物构象的发现，同时进一步整合结构引导和AI辅助药物设计与构象特异性药物筛选。

纳米抗体因其结构简单，可以开发成多种形式，如单价Nb（monovalent，1 Nb结合1个免疫表位），双价Nb（bivalent，2 个链接的Nb结合到同一免疫表位），双特异性Nb（bispecific，2个链接的Nb链接结合到不同靶点), 双抗体结合位点Nb（biparatopic，2个链接的Nb结合同一靶点上的2个免疫位点），及3价Nb（trivalent，链接3个Nb）等。不同结构的纳米抗体能够增加Nb亲和力和效能，可获得不同的药理学作用。这些膜外纳米抗体与GPCR结合，能够展示出拮抗剂（antagonist）作用，反向激动剂（inverse agonist）作用，反向或正向别构调节剂（NAM, negative allosteric modulatotor；PAM，positive allosteric modulator）作用。

GPCR是一个庞大的膜蛋白家族，在人体的代谢、细胞生长、生理功能中发挥着巨大的作用，具有十分辽阔的前景。但不可否认的是GPCR研究中存在着一定的技术壁垒。那么如何保证GPCR蛋白靶点的高质量以及助力研发GPCR抗体药物的有效性成为药物研发的难点，纳米抗体凭借体积微小、具有高特异性、高亲和力、独特的结合位点的特点则成为打破壁垒的关键所在。

[1] Ísberg, Vignir, Stefan Mordalski, Christian Munk, Krzysztof Rataj, Kasper Harpsøe, Alexander Sebastian Hauser, Bas Vroling, Andrzej J. Bojarski, Gert Vriend and David E. Gloriam. “GPCRdb: an information system for G protein-coupled receptors.” Nucleic Acids Research 44 (2016): D356 - D364.

[2] Muyldermans, Serge, Toya Nath Baral, V Cortez Retamozzo, Patrick De Baetselier, Erwin J De Genst, Jorg Kinne, Heinrich Leonhardt, Stefan Magez, Viet Khong Nguyen, Hilde Revets, Ulrich Rothbauer, Benoît Stijlemans, Sergei V. Tillib, Ulrich Wernery, Lode Wyns, Gholamreza Hassanzadeh-Ghassabeh and Dirk Saerens.”Camelid immunoglobulins and nanobody technology”.Veterinary immunology and immunopathology 128 1-3 (2009): 178-83 

[3] Wesley K. Kroeze, Douglas J. Sheffler, Bryan L. Roth; G-protein-coupled receptors at a glance. J Cell Sci 15 December 2003; 116 (24): 4867–4869. 

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[6] Laeremans T, Sands ZA, Claes P, De Blieck A, De Cesco S, Triest S, Busch A, Felix D, Kumar A, Jaakola VP, Menet C. Accelerating GPCR Drug Discovery With Conformation-Stabilizing VHHs. Front Mol Biosci. 2022 May 23;9:863099. doi: 10.3389/fmolb.2022.863099. PMID: 35677880; PMCID: PMC9170359.