Crystalo Biopharma晶蛋生物

新冠病毒仍在不断变异，近日消息美国康涅狄格州竟出现了刷新最新认知的B.1.517变异毒株，其主要原因为该变体在世界各地已经消失了良久。虽然，全球新冠药物开发取得了进展，但是鉴于病毒惊人的变异速度，临床仍迫切需要疗效更优，更广谱的抗冠状病毒药物，以及时和有效地治疗SARS-CoV-2感染。

鉴于此，早前晶蛋生物对辉瑞已上市的新冠特效药Paxlovid（PF-07321332）的前药PF-07304814开展系列研究，目前研究成果《Structural Basis of Main Proteases of Coronavirus Bound to Drug Candidate PF-07304814》在分子生物学杂志JMB上发表。

该文章主要报道了PF-07304814与四种人感染冠状病毒(HCoV-NL63、MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2)的Mpro复合物的晶体结构；PF-07304814和PF-00835231对不同冠状病毒主蛋白酶的抑制活性并基于结构的方法评估其有效性和抑制机制；以及对PF-07304814和PF-00835231分别结合SARS-CoV-2 Mpro的模式进行研究等。以上成果可加快更安全、更有效的广谱冠状病毒主蛋白酶抑制剂的研发。

图1 SARS-CoV、MERS-CoV和HCoV-NL63 Mpro与PF-07304814复合物的晶体结构

在研究中，我们解决了PF-07304814与四种人感染冠状病毒(HCoV-NL63、MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2)的Mpro复合物的晶体结构（图1）。其结构表明，PF-07304814与Mpro的催化半胱氨酸共价结合，并与活性位点内的保守残基形成多个氢键。与PF-00835231相比，PF-07304814采用了与SARS-CoV-2 Mpro相似的结合模式，但存在一些关键的差异。这些数据补充了之前关于PF-00835231与SARS-CoV-2和SARS-CoV复合物结构的报道，有助于全面了解PF-07304814和PF-00835231的抑制机制，从而为药物开发提供结构基础和关键的见解。

图2  PF-07304814和PF-00835231对不同冠状病毒主要蛋白酶的酶促抑制作用

研究中，我们对HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV-2和MERS-CoV的Mpro进行了表达并纯化，并测定PF-07304814和PF-00835231对这些Mpro的抑制活性。结果得出PF-00835231对这四种Mpros的抑制作用半抑制浓度值为0.0086μM~0.3839μM（图1），表明其具有广谱抑制活性。

表1  Mpro-PF-07304814复合物的数据处理和模型细化的统计数据

另外，我们使用共结晶法测定的SARS-CoV-2 Mpro与PF-07304814复合物在1.97Å分辨率下的晶体结构（表1），可了解PF-07304814的抑制机制。如图3所示，复杂结构中的Mpro分子由两个原聚体(A和B)组成，每个原聚体包含三个不同的结构域。然而，PF-07304814只能在原聚体B中找到(图3(A))。具体来说，PF-07304814以扩展构象结合到位于Mpro结构域I和II之间的活性位点，占据了SARS-CoV-2 Mpro的S1、S2和部分S3口袋，但不占据该蛋白酶的典型S4位点(图3(B))。电子密度图明确显示，PF-07304814的HMK弹头的碳基碳与Mpro活性位点半胱氨酸(Cys145)的硫原子形成了共价键，生成四面体碳醇复合物(图3(C))。除了典型的共价相互作用外，PF-07304814还在活动站点内形成多种非共价相互作用。这些都进一步阐明PF-07304814优于其他抑制剂的原因，为广谱抗冠状病毒药物的设计提供了新的依据。

图3   SARS-CoV-2 Mpro与PF-07304814复合物的晶体结构

并且，我们的研究发现Mpro-PF-00835231和Mpro-PF-07304814复合物的叠加显示出很高的相似性，等效Cɑ位置的均方根偏差为1.107Å(图4(A))。PF-07304814和PF-00835231均与Gln189、His163、His164、Glu166、Phe140和Cys145形成氢键作用(图4(B))。与S10口袋中残基的相互作用差异最大！结合模式的差异可能导致了抑制活性的差异，这也为进一步开发和优化新冠特效药提供了坚实的基础。

图4   PF-07304814与PF-00835231的结合模式的比较

PF-07304814、PF-07321332和GC-376代表了针对SARS-CoV-2主蛋白酶的最先进的候选药物。其中，PF-07321332是通过PF-07304814修饰而成，是拟肽化合物GC376的类似物，已被许可用于治疗由猫冠状病毒引起的猫感染性腹膜炎。近年来，GC376和PF-07321332与SARS-CoV-2 Mpro复合物的晶体结构也得到了解决。它们都与催化半胱氨酸形成C-S共价键（图5），通过与Phe140、His163和Glu166形成多个氢键作用占据S1口袋。

图5   四种针对SARS-CoV-2 Mpro的抑制剂结合模式的比较

PF-07304814和PF-00835231在P2位置与GC376的结合模式相似。这三种抑制剂的P3位置与S3口袋并不匹配，这表明需要进行结构优化来确定更适合该亚位点的基团，这些结构也将促进分子药物的开发和优化，加速针对当前大流行的Covid-19和未来潜在的大流行的有效药物开发进程!