Time:2022-06-01Author:小O
导读
近年来,大分子生物药(单抗,双抗,ADC以及干扰素)研发热潮一浪高过一浪,这并不代表小分子药物市场的衰退,恰恰相反,小分子药物因其独特的优势(可以靶向胞内胞外,研发成本相对较低,工艺相对熟练),依然是新药研发的主战场。从2020年FDA批准了53个新药,而小分子新药占了38个这个数据就可证实。此外,小分子药在生物药冲击的浪潮之下,并没有固步自封,闭门造车,而是不断更新技术。如图1,各种蛋白降解技术(PPOTACs、LYTACs、Molecular Glue、AUTAC等)作为新兴小分子药物研发的一个利器,引领创新药风向从传统药物靶标(占人体靶点约20%)转向更具挑战性的“不可成药”靶标(占人体靶点约80%)。
图1 蛋白降解技术简图5
细胞在维持体内环境稳态的过程中,需要将细胞代谢、营养感知、质膜修复、分泌过程以及应激等病理过程产生的“废料”清除,而清除的过程中需要用到的两大蛋白质和细胞器降解系统分别是:泛素-蛋白酶体系统,溶酶体系统。大部分蛋白降解技术都是围绕着这两个体系发展延伸的,让小0带领大家一起学习各种蛋白降解技术吧。
泛素-蛋白酶体系统
基于泛素-蛋白酶体系统的PROTAC技术和分子胶技术是蛋白降解技术发展的“双子星”。相比其他还处于发展中的技术,这两项技术的发展以及遥遥领先。
1PROTAC技术
蛋白降解靶向嵌合体PROTAC是一种杂合双功能多肽或小分子化合物,PROTACs分子量一般在700~1200之间。其结构类似于哑铃,一端是泛素连接酶E3配体,另一端是与细胞中目标靶蛋白结合的配体(POI),两端之间通过Linker相连,从而形成“三体”聚合物—靶蛋白配体-Linker-E3配体。如图2,E3泛素连接酶可通过将一种叫做泛素的小蛋白“粘贴”在靶蛋白上,将靶蛋白标记为缺陷或受损蛋白,然后,利用细胞内在的蛋白“粉碎机”(即26S蛋白酶体)可以识别和降解被标记的靶蛋白。简而言之,就是标靶蛋白被打上泛素化标签-被识别-被降解。
图2 PROTAC作用机制(网图)
PROTAC新兴技术很多,以下简单介绍几种有代表性的PROTACs:
光控PROTAC:Trauner课题组开发一种光控的蛋白质降解技术(PHOTAC),通过将偶氮苯结构作为光开关,引入到PROTAC分子结构中,从而实现光诱导的靶蛋白降解。
抗体-PROTAC偶联物:Tate课题组将PROTAC概念应用到抗体偶联药物的设计中,通过将曲妥珠单抗与PROTAC进行偶联,选择性降解HER2阳性细胞的溴结构域蛋白4(BRD4),从而实现PROTAC技术的细胞特异性。
抗体类AbTAC:如图1,AbTAC也通过内吞-溶酶体途径诱导胞外蛋白和膜蛋白的降解,因此AbTAC虽然冠PROTAC之名,但与LYTAC的关系更为密切。AbTAC本质上是一个重组的双特异性抗体,一个臂靶向细胞表面的目标蛋白,一个臂靶向跨膜的E3连接酶,例如RNF43(RNF43是一个单次跨膜的E3连接酶,包含膜外结构域,跨膜结构域和RING细胞内结构域),从而引起三元复合物的内吞和溶酶体降解。第一个AbTAC由加州大学旧金山分校的Wells课题组开发,通过重组双特异性抗体成功将肿瘤细胞表面的PD-L1分子成功引导到溶酶体降解。相对LYTAC,AbTAC能降低嵌合体分子的免疫原性,但其是否可以回收再利用等具体机制还有待研究。
纳米抗体GlueTAC:北京大学的陈鹏课题组首次报道了基于纳米抗体构建的GlueTAC技术。如图3,研究人员对天然的纳米抗体进行了改造,在纳米抗体CDR3的结合区域引入了一个非天然氨基酸(红色火柴头),这使得改造后的纳米抗体和靶蛋白形成共价键的牢固结合,一旦和靶蛋白形成特异性结合后,很难再解离。改造后的纳米抗体被命名为Glueody(浅蓝色)。为了提高内吞效率的稳定性研究人员在Gluebody上耦连(Sortase A介导的蛋白耦连)了CPP-LSS多肽(CPP浅灰色、LSS深蓝色)。
图3 GlueTAC作用机制1
分子胶Molecular Glue技术
分子胶通过修饰泛素化连接酶表面进行改性,从而识别并降解目标蛋白。与PROTAC类似,分子胶技术也可以引起靶蛋白的泛素化和降解。与PROTAC不同的是分子胶是小分子量化合物,并且能够作用于没有小分子结合口袋的不可成药靶点(注:人体细胞中~80%蛋白没有小分子结合口袋)。
双机制降解剂技术
双机制降解剂(Double-mechanism degrader)则是单一分子可分别扮演PROTAC和分子胶的角色,诱导两种目标蛋白的降解,有提升治疗效果的潜力。清华大学药学院的饶燏教授团队开发了一种代号GBD-9的小分子,其可以作为PROTAC促进BTK降解,也可以作为分子胶促进翻译终止因子GSPT1的降解。在多种癌细胞系中显示出比小分子BTK抑制剂依鲁替尼更强的抗肿瘤作用,有可能克服BTK抑制剂无法治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤以及急性髓细胞白血病。
溶酶体系统
溶酶体是一种酸性细胞器,通过内吞和自噬作用从质膜或细胞质中接收物质,并将其降解和循环利用。内吞的物质被结合,并通过早期的内体、内体载体小泡、晚期的内体和溶酶体进行随后的水解。自噬途径始于一种被称为吞噬载体的孤立的膜结构,该结构来源于脂质双层和脂化的LC3蛋白。这种吞噬体会膨胀,吞噬细胞内的货物(自噬底物),包括蛋白质和其他生物分子,甚至细胞器,从而将它们隔离在一个叫做自噬小体的双层小泡中。装载的自噬体会随着蛋白的降解而成熟。因此,内体/溶酶体途径和自噬途径都能够降解靶物质。如图4,LYTAC、ATTEC和AUTAC技术是目前进展较快的溶酶体体系蛋白降解剂。
图4 溶酶体系统的蛋白降解技术2
内吞-溶酶体途径
内吞-溶酶体途径主要负责胞外蛋白与跨膜蛋白的降解,在细胞的营养摄取、信号传递、抗原呈递和储存等过程中发挥着重要作用。溶酶体靶向嵌合体LYTAC技术利用内吞-溶酶体途径,有效地实现胞外蛋白和膜蛋白的降解。
如图4A,LYTAC主要由两个结合域组成,其中一个是靶向细胞表面的溶酶体靶向受体LTR(lysosome-targeting receptor)的寡聚糖结构,另一个是靶向靶蛋白的抗体、多肽或小分子,两者通过一个Linker连接在一起。目前已报道的溶酶体靶向受体主要有两种,分别是非阳离子依赖型20-或90-聚体的甘露糖-6-磷酸受体(cation-independent mannose-6-phosphate receptor,CI-M6PR)和去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)(图5)。LYTAC与PROTAC不同,PROTAC通过蛋白酶体降解靶蛋白,通常适用于细胞内蛋白。而LYTAC可以通过细胞膜表面的溶酶体靶向受体诱导蛋白质向溶酶体迁移,因而也可以靶向细胞外蛋白和跨膜蛋白,且不依赖于泛素化和蛋白酶体。
图5 LYTAC的两种受体形式3
双特异性核酸适体嵌合体(Bispecific aptamer chimera)和LYTAC类似,也通过内吞-溶酶体途径介导目标蛋白降解。但其化学本质与LYTAC不同,其由两个分别靶向目标蛋白和LTR的核酸适体偶联得到,也是通过与LTR及目标蛋白形成三元复合物内吞来降解目标蛋白。上海交通大学的韩达报道了第一个双特异性核酸适体嵌合体,实现了对间质表皮转化因子c-Met和酪氨酸蛋白激酶7的快速降解,在抗肿瘤方面有较好的开发潜力。相较于LYTAC,双特异性核酸适体嵌合体有制备更为简单、连接方式确定、稳定性更好的优点。
自噬-溶酶体途径
自噬是细胞清除自身受损或无用蛋白质或细胞器,维持细胞的稳态和正常生命活动的重要过程。利用自噬途径开发的蛋白质降解技术主要有AUTEC、ATTEC及基于CMA的嵌合体技术。
如图4B,自噬体束缚化合物AUTAC主要由3部分组成,分别是靶蛋白的靶向配体、Linker和降解标签鸟嘌呤衍生物(GD)。AUTAC的作用原理是通过降解标签模拟S-鸟苷酸化修饰,诱导靶蛋白的多聚泛素化,进而招募自噬体实现溶酶体途径降解。AUTAC与PROTAC相似,也是通过诱导靶蛋白的多聚泛素化实现蛋白质降解,但是AUTAC分子不是将POI拴在E3连接酶亚单位上并触发K48多泛素化,而是触发K63多泛素化,K63多泛素化被选择性的自噬途径识别,导致靶POI的降解,因此具有更加广泛的降解范围,不仅可以降解细胞质蛋白,还可以实现降解个头较大的细胞器,包括内质网、线粒体和过氧化物酶体等。
如图4C,ATTEC即自噬小体绑定化合物,该化合物可同时作用于靶蛋白和自噬小体蛋白LC3,从而拉近靶蛋白与LC3之间距离,实现两者的捆绑。LC3可进一步诱导自噬泡包裹靶蛋白,形成自噬小体,随后将自噬小体运输到溶酶体,从而实现靶蛋白的降解。ATTEC可以与关键的自噬蛋白LC3和致病蛋白(如图突变mHTT蛋白)特异性结合,而不与正常蛋白结合,并且可以将病原性材料包装到自噬体中进行降解。ATTEC分子通过直接与自噬蛋白LC3相互作用,绕过泛素化过程,具有很大的潜力降解不同类型的靶标,包括自噬识别的非蛋白质货物,如DNA/RNA分子,受损的细胞器等。一些ATTEC分子能够通过血脑屏障,并在约100 nm的浓度下发挥作用,这为药物发现提供了别致的切入点。
同样通过绕过泛素化过程与自噬蛋白结合的还有自噬靶向嵌合体AUTOTAC分子(图1),该分子由三部分组成:目标蛋白的配体、linker、可启动自噬的p62蛋白的配体。AUTOTAC同时结合目标蛋白和p62的ZZ结构域,并促进p62的寡聚化和活化,使目标蛋白降解。AUTOTAC不仅可以介导雄激素受体等单体蛋白的靶向降解,还能介导与阿尔兹海默相关的聚集性Tau蛋白的降解,这一点便是AUTOTAC相比PROTAC的优势所在,为蛋白降解领域提供了一个针对聚集性蛋白的新策略。
图6 AUTOTAC工作机制6
如图7,CMA嵌合体是利用CMA机制设计的一类双功能分子,主要是嵌合多肽。首先,蛋白HSP70的复合物识别靶蛋白的KFERQ基序,与靶蛋白形成大复合物;随后,该大复合物与溶酶体相关膜蛋白2A(LAMP2A)相互作用,LAMP-2A经过多聚合、底物异位最终实现溶酶体自噬降解。
图7 CMA作用机制4
表12,5各种蛋白降解剂对比
总结
目前,蛋白降解疗法已成为备受医药企业青睐的研发方向之一。其中发展最快的是分子胶和PROTAC技术,BMS的分子胶来那度胺年销售额已达128.91亿美元,Arvinas的PROTAC分子ARV-471今年将启动III期临床,基于溶酶体的靶向降解发展时间较短,目前仍处于临床前阶段。随着科学的进步和技术的发展,蛋白降解疗法可以取得更多突破性的进展,研发出更多First-in-class药物,早日造福广大患者。
蛋白降解技术虽然热门,但是仍然存在很多疑问,小O浅谈几点:
1. LYTAC目前主要是大分子,如何变成小分子,怎么解决高聚合度大分子量导致的体内代谢困难问题?
2. AUTAC导致靶蛋白K63泛素化的机制是什么?
3. ATTEC与LC3结合的结构生物学基础是什么?
4. PROTAC依赖特定几个E3泛素化连接酶的表达以及蛋白酶体介导的降解,如何走出局限发展新技术?